导读

【CRISPR介绍】系列文章，前两篇我们重点关注了CRISPR技术的发展史、应用和分类，而自该技术问世以来，除在基因编辑领域已有诸多应用外，在诊断领域的发展同样迅速。尤其以Cas12和Cas13为代表的单Cas酶反应体系更是获得快速发展。本篇文章主要针对基于CRISPR/Cas技术的不同系统在诊断领域的应用进行介绍。

在基因编辑领域，CRISPR/Cas9最早被应用，其在诊断领域的开发也有报道。该系统通过把Cas9和PCR进行结合开发了一种针对寨卡病毒分型的特异性检测方法（图1）。

图1 基于Cas9开发的寨卡病毒检测系统

2016年，张锋团队首次阐述了CRISPR/Cas13a系统的功能和机理，即Cas13a与sgRNA复合物特异性识别靶RNA后激活其非特异性降解其他RNA的功能。基于该原理，张锋团队创造了SHERLOCK（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking）系统（图2）。该系统首先对靶基因进行扩增（RPA或RT-RPA恒温扩增），再将扩增产物转录为RNA分子，与Cas13a/crRNA特异结合形成复合物，激活Cas13a的反式切割活性，对体系中荧光标记的FQ-ssRNA探针进行切割，发出荧光。该系统展现出的单分子级别的检测灵敏度及单碱基的特异性，是CRISPR-Dx领域中具有里程碑意义的重要工作。

该系统可应用在病原检测、基因型区分、耐药性基因以及肿瘤液体活检的即时检测等领域。以该技术为基础开发的新冠检测产品在2020年5月获得了新冠检测的EUA，成为全球第一个注册获批的CRISPR诊断试剂。

但该产品存在两个问题：单靶检测和两步法即扩增与检测之间需要开盖转移；扩增后的核酸易造成气溶胶污染。针对这两个问题，该团队进行了相应的改进，1、推出了SHERLOCK V2：在体系中加入csm蛋白，进一步提高灵敏度，同时根据对不同报告基因的切割偏好性，也加入多种Cas蛋白，实现单次检测多个靶标的目的，并将纸基传感器引入系统，使结果直接用肉眼进行判断。这种可视结果为现场检测提供快捷、简便的实现途径。2、推出了STOP技术（SHERLOCK Testing in One Pot）：该技术直接使用裂解后的样本，且采用AaCas12b酶一步法（边扩增边检测）完成整个检测过程。为进一步提高灵敏度，通过改良提取方式，形成STOP V2系统（图3），即通过加入磁珠富集样本中RNA，提高了起始RNA量。

DETECTR（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter）在2018年由Jennifer Doudna团队研发，是另一种基于CRISPR系统的诊断方法。该方法基于LbCas12a蛋白开发，同样该蛋白具有反式切割活性，不同的是其对单链DNA（ssDNA）有较高的切割活性。当靶标核酸存在时，通过恒温扩增（RPA方法）特定产物，并通过Cas12a和sgRNA复合物进行特异性识别，同时激活Cas12a反式切割活性，将FQ-ssDNA报告探针切割并发出荧光。

图4 DETECTR检测系统

DETECTR系统（图4）从流程上更有优势，不仅步骤上更少，而且所用到的探针为ssDNA探针，合成便宜且保存稳定。经测试和验证，该系统能够从临床样本中快速而准确地检测出与宫颈癌相关的16和18型的HPV，具有高特异性。

同样，在2020年底，基于该系统的新冠诊断试剂获得了EUA。为了应对大规模的筛查，在2022年初，FDA又授予DETECTR BOOST（图5）新冠检测试剂的EUA，这是第一款基于CRISPR的高通量新冠检测产品，将CRISPR与自动化相结合，用于SARS-CoV-2大规模检测。

该系统是一款基于CRISPR的一站式分子诊断系统，能够实现高通量，从样本到结果，具有与PCR相当的性能，且使人工操作时间最小化。

与SHERLOCK相似，为了解决两步法的气溶胶污染以及进一步提高检测灵敏度与特异性，并减少检测时间，该团队在DETECTR的基础上提出了Cas12aVDet。该方法将恒温扩增与基于Cas12a的CRISPR检测整合在一个系统中，将检测时长从2个小时缩短至30分钟内。

上述两个系统是由国外研究团队在诊断方向进行的探索，而在国内同样有优秀的团队在进行研究，比较有代表性的是HOLMES和CDetection系统。

几乎与DETECTR系统开发同时，国内王金教授团队同样利用Cas12a的反式切割活性开发了HOLMES（one-hour low-cost multipurpose highly efficient system）系统（图6）。与前两种系统不同的是，HOLMES系统通过PCR步骤实现模板扩增。在此基础上，该团队又做了多种实验，证明了ssDNA和dsDNA靶标都能激活Cas12a的反式切割活性，包括证明了多个物种的Cas12a都有反式切割活性，为后面HOLMES体系中的Cas12a筛选提供了基础。

随后，该团队又基于LAMP-Cas12b开发了HOLMES V2系统（图7），并开发了One-Pot一步法CRISPR诊断体系。

图7 HOLMES V2系统

测试数据显示，Cas12b的反式切割活性对ssDNA的亲和力要好于dsDNA，具有更宽的反应温度范围，而且灵敏度与Cas12a相当。

CDetection是Cas12b-mediated DNA detection的缩写，由中科院周淇院士团队开发的新型CRISPR诊断系统，具有独立知识产权。AaCas12b-sgRNA复合物特异性识别靶标基因后，激活其反式切割活性，高效的切割体系内ssDNA荧光报告分子，从而发出荧光信号。

图8 CDetection的检测灵敏度（以HPV16/18为例）

图9 CDetection 对SNP的检测能力（以肿瘤BRCA1为例）

迅识生物通过深度优化，基于CDetection技术研发了新冠检测试剂，单管实现边扩增边进行CRISPR检测，极大的避免了气溶胶污染的风险（图10）。

图10 一步法CDetection技术系统

本篇文章我们系统性的回顾了具有代表性的CRISPR/Cas诊断平台，通过汇总发现（表1），各方法应用集中在病原、SNP和肿瘤检测等领域，但各平台所呈现的特点不尽相同，而且中间还经历了从两步法逐渐向一步法过渡的过程。

表1 基于CRISPR/Cas系统的不同诊断平台

虽然该诊断平台起步晚，从发现反式剪切活性到现在才短短6年时间，但随着越来越多Cas蛋白的发现和研究，使得该技术的延展性和潜力巨大。

基于该诊断平台的分子诊断技术简单、快速，搭载恒温扩增则无需复杂仪器，在近期的新冠疫情中已有注册获批的产品。但该技术仍然有较大的提升空间，比如多重检测性能，以及正在大力开发的免扩增技术，在POCT检测领域具有改变“游戏”规则的潜力，从而为疾病筛查和传染病防控多了一个更加新颖和可行的选择。

参考文献：

1.Rapid,Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.

2.Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.

3.Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot Testing.

4.HOLMESv2: A CRISPR-Cas12b-Assisted Platform for Nucleic Acid Detection and DNA Methylation Quantitation.

5.CRISPR Approaches for the Diagnosis of Human Diseases.