CRISPR介绍---CRISPR发展史

1987年，日本大阪大学(Osaka University)的科研人员在对大肠杆菌中碱性磷酸酶同工酶基因进行鉴定时，意外的发现了一段重复的DNA序列，即包含24个核苷酸的5个同向重复序列，但并不清楚该段序列的生物学意义和CRISPR/Cas的关联。1993年，在研究古细菌时，CRISPR首次被证实，随后越来越多的类似序列被发现和确认。

20世纪末，研究人员通过比对发现，这种重复序列存在于20多种细菌及古生菌中，并将其命名为短规律性间隔重复序列（Short Regularly Spaced Repeats, SRSRs)，而后又将上述重复的DNA序列修订为CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)，临近的基因称为Cas基因（CRISPR associated基因）。2007年，Horvath研究组认为CRISPR及cas基因一起为嗜热链球菌提供了对噬菌体的抗性作用，同时其特异性取决于CRISPR中的间隔区序列，这是CRISPR的免疫功能首次在细菌中得到实验证实，后续的研究又证明了前间隔序列临近基序（PAM）基因能够为该系统发挥功能提供识别作用。为了进一步了解这个免疫系统，Charpentier在对化脓性链球菌进行研究期间，发现CRISPR/Cas9作为细菌的免疫系统，可以切割病毒的DNA以抵抗病毒入侵。从此，细菌获得性免疫系统CRISPR/Cas作用机制被基本阐明。随着研究的深入，CRISPR和Cas蛋白之间的进化关系也逐步得到了更深的了解，形成了以Cas1和Cas2基因为核心构成的三种不同类型的CRISPR/Cas系统，其中，I型和III型系统需要多种蛋白共同参与才可以发挥作用，而II型系统就简单很多，只需要一种标志性的Cas蛋白即Cas9便可完成DNA识别和剪切，正是由于CRISPR-Cas9系统这种简洁、易操作的特点，为其进一步的应用奠定了坚实基础。

Structure of CRISPR/Cas

2012年，Charpentier和Doudna在体外重现了基因剪刀CRISPR/Cas9，能够在指定位点切割 DNA。紧接着在2013年，麻省理工张峰团队率先证实CRISPR/Cas系统同样能够在真核细胞中起作用。随着研究的继续深入，CRISPR/Cas9也暴露了缺陷和局限性，例如严重的脱靶效应，随后通过不断的努力，科学界逐步降低了CRISPR/Cas9系统应用中的脱靶效应等风险，更有助于该技术在疾病模型建立、抗癌药物研制、干细胞治疗等生物和医学等领域的应用。世界各国的研究人员也纷纷利用该技术，探索了在不同领域的基因编辑应用。如利用CRISPR基因编辑技术对人淋巴细胞进行改造，从而使得这些细胞能够攻击人T细胞癌，为肿瘤的新疗法提供可能性。

CRISPR gene-editing

随着CRISPR技术的进一步发展，一些新的Cas蛋白（Cas12/Cas13/Cas14）不断被发现，它们区别于Cas9，即在识别某种序列之后，会同时激活其切割能力，切割体系中的DNA或RNA。利用其快速、特异性强等特点，科学界也在开发新的诊断工具，特别是CRISPR系统在病原体、肿瘤基因诊断领域的快速检测应用上。最初发现的有两种：（a）SHERLOCK系统：Cas13a能够在与靶基因结合后，激活其切割活性，继续切割系统中带有荧光基团的RNA报告分子。当报告分子被切割时，通过检测发出的荧光，实现检测目的；（b）DETECTR系统：类似的原理，采用Cas12a实现非特异性ssDNA的检测。

Nucleic acid detection platform of SHERLOCK

同时，其他国家的科学家也在陆续研究和开发新的CRISPR/Cas系统。2019年，中国科学院动物研究所李伟团队发现Cas12b系统在激活之后具有任意切割ssDNA的特性，并成功开发出 CDetection（Cas12b-mediated DNA detection）技术，同样实现了微量DNA的简便快速检测。

Cas12b-mediated DNA detection

自新冠疫情爆发后，基于CRISPR系统的SARS-CoV-2核酸检测试剂也已上市，如基于SHERLOCK、DETECTR等CRISPR/Cas系统的试剂盒均已获得美国FDA的紧急授权使用，这是FDA首次授权使用CRISPR技术进行传染病检测。国内企业也相继开发了基于CRISPR/Cas系统的新冠核酸检测产品，如杭州众测和上海伯杰公司也于近期均注册获批了新冠核酸检测试剂。

最后，总结一下CRISPR的发展历程如下：

Timeline of the CRISPR–Cas system with important milestones

尽管CRISPR技术在人类基因组编辑和诊断中的应用还需要更加全面的研究，但已经在基因编辑和诊断的应用中显示出了强大的能力。随着技术的不断发展，CRISPR系统会被广泛应用于感染性和遗传性疾病的检测及治疗、癌症的治疗以及农作物等方面，以解决人类的不同需求。

参考文献：

1. CRISPR/Cas – genome editing is becoming increasingly popular, 2016

2. Novel CRISPR–Cas Systems: An Updated Review of the Current Achievements, Applications, and Future Research Perspective, 2021

3. Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy, 2021

4. CRISPR-Based Diagnosis of Infectious and Noninfectious Diseases, 2020

5. Crystal Structure of Cas9 in Complex with Guide RNA and Target DNA, 2014

6. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a C2c2, 2017

7. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6, 2018

8. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate singlestranded DNase activity, 2018

9. CDetection: CRISPR-Cas12b-based DNA detection with sub-attomolar sensitivity and single-base specificity, 2019

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